Experiment des Monats Februar 2005 Aminosäure-Nachweise

Als Nachweisreagens für Aminosäuren dient Ninhydrin. Diese Reaktion ist mit allen proteinogenen Aminosäuren außer Prolin positiv. Mit den hier vorgestellten Reaktionen lassen sich bestimmte Aminosäuren selektiv nachweisen.

Geräte und Chemikalien:
SAKAGUCHI-Reagenz A: 50 mg 1-Naphthol + 5 g Harnstoff in 100 ml Ethanol
SAKAGUCHI-Reagenz B: 0,7 ml Brom + 5 g NaOH in 100 ml Wasser
PAULY-Reagenz A: 0,5 g Sulfanilsäure in 100 ml 2%ige Salzsäure
PAULY-Reagenz B: 0,5 g NaNO₂ in 100 ml Wasser
10%ige Na₂CO₃-Lösung
ELLMANN-Reagenz: 0,4 g DTNB = 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) in 100 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0
0,05-molare Lösungen von L-Alanin, L-Arginin, L-Histidin, L-Cystein und L-Tyrosin in dest. Wasser
Reagenzgläser oder Eppendorf-Gefäße, Eppendorf-Pipetten.

SAKAGUCHI-Reaktion:
In einem Reagenzglas zu 100 µl einer Aminosäure-Lösung 100 µl des Sakaguchi-Reagenz A und das gleiche Volumen Reagenz B geben. Nur bei Arginin bildet sich ein orange-roter Farbstoff. Die Färbung verblaßt nach kurzer Zeit.

PAULY-Reaktion:
Je 100 µl Pauly-Reagenz A und B mischen. Dabei erfolgt die Diazotierung der Sulfanilsäure. Nach etwa 1 Minute 400 µl der Aminosäure-Lösung zugeben. Intensiv durchmischen und durch tropfenweise Zugabe einer Na₂CO₃-Lösung alkalisieren. Mit Tyrosin entsteht eine dunkelrote Färbung, mit Histidin eine intensiv orange-rote. Bei den anderen Aminosäuren tritt nur eine leichte Gelbfärbung auf.
Bei der Reaktion kommt es zur Kupplung des Diazoniumsalzes mit den aromatischen Ringsystemen in den Seitenketten von Tyrosin und Histidin: es entstehen Azo-Farbstoffe.

ELLMANN-Reaktion:
100 µl Aminosäure-Lösung mit 200 µl DTNB-Lösung versetzen. Mit Cystein entsteht eine dunkelgelbe Lösung, mit den anderen Aminosäuren bleibt die Lösung farblos.
Die Thiol-Gruppe des Cysteins reagiert mit 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) unter Spaltung dessen Disulfid-Brücke. Es entsteht ein neues Disulfid mit Cystein, ein Molekül 2-Nitro-5-thiobenzoesäure (TNB) wird freigesetzt. TNB ist intensiv gelb gefärbt, DTNB farblos.

Gefahren:
Brom ist sehr aggresiv, ätzend und giftig. Die Lösung im Abzug herstellen. Natriumnitrit ist giftig. 1-Naphthol und Sulfanilsäure sind gesundheitsschädlich und reizend, Salzsäure und Natronlauge ätzend. Ethanol ist leichtentzündlich.

Entsorgung:
Die Lösungen werden zum organischen Abfall gegeben.

Literatur & Links:
Kleber/Schlee/Schöpp: "Biochemisches Praktikum" - S. 51-54
Biochemisches Praktikum, Philipps-Universität Marburg

Herrn Andreas Goebeler, Philipps-Universität Marburg, danke ich sehr herzlich für die Unterstützung.

Januar 2005: Komplexe Salze

Archiv

Register

zurück zum aktuellen Experiment

Seite erstellt am: Montag, 31. Januar 2005, A. Schunk, PU Marburg.

Für den Inhalt externer Seiten wird keine Verantwortung übernommen!