Experiment des Monats Mai 2012 Carboanhydrase

Die Carboanhydrase katalysiert die Einstellung des Gleichgewichts zwischen Kohlendioxid und Hydrogencarbonat. Diese Reaktion ist von großer Bedeutung für die pH-Regulation im Blut und Cytoplasma; etwa 75% der Puffer-Kapazität im Blutplasma enfällt auf den CO₂/HCO₃^–-Puffer. Die Gleichgewichtseinstellung muß sehr schnell erfolgen, da Veränderungen des pH-Werts zu Funktionsstörungen von Proteinen und Membranen führen. Die Carboanhydrase gehört zu den am schnellsten arbeitenden Enzymen.

Geräte und Chemikalien:
Reagenzgläser, Meßpipetten, Pasteurpipetten, Reagenzglashalter, Bunsenbrenner
zur Blutabnahme: Impflanzetten, Desinfektionsmittel, Tupfer, Mikropipette/Mikrovette
0,02 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung, 0,05 M Natronlauge, Phenolrot-Lösung (12,5 mg in 100 ml NaHCO₃-Lösung).

Durchführung:
Aus der Fingerbeere werden 30 µl Kapillarblut entnommen (desinfizieren; mit der Impflanzette seitlich einstechen; mit der Mikrovette 30 µl aufziehen; Abb. 1). Die Blutprobe wird in 3 ml dest. Wasser gegeben, gut gemischt und die Lösung dann auf zwei Reagenzgläser verteilt.
Eine Probe dieser Lösung wird bis zum Sieden erhitzt und 1-2 Minuten gekocht. (Abb. 2)
Zwei weitere Reagenzgläser werden mit jeweils 5 ml NaHCO₃-Lösung gefüllt. 4 Tropfen Phenolrot-Lösung zugeben. Nun in beide Reagenzgläser so lang Ausatemluft blasen, bis ein Farbumschlag eintritt (Ab. 3). (Abb. 4: rechts vor, links nach dem Einblasen)
In das erste Reagenzglas werden 0,5 ml der frischen Blutproben-Lösung gegeben, in das zweite Reagenglas 0,5 ml der gekochten Lösung. Zu beiden Proben 50 µl Natronlauge pipettieren und schütteln. Im ersten Reagenzglas (nicht gekocht) stellt sich sofort wieder die orange Färbung ein, der zweite Ansatz bleibt rot-violett. (Abb. 5)

Erklärung:
Phenolrot schlägt bei pH 7,3 von orange-gelb nach rot-violett um. Kohlensäure hat pK_S 6,35. Wird in die HCO₃^–-Lösung (pH > 8) CO₂ eingeblasen - ausgeatmete Luft enthält etwa 4-5% CO₂ - stellt sich das Puffer-Gleichgewicht ein:
             CO₂ + H₂O H₂CO₃ H⁺ + HCO₃^–
Der Indikator schlägt um nach gelb-orange. Zugegebene Laugen (oder Säuren) werden abgepuffert (so lange die Pufferkapazität ausreicht, EdM 02/2009), d.h. der pH-Wert stellt sich wieder nahe des Ausgangswerts zurück. Die Feinregulation benötigt jedoch etwas Zeit. Die Carboanhydrase aus der Blutprobe beschleunigt die Gleichgewichtseinstellung drastisch, so daß der Farbumschlag im ersten Fall sofort wieder eintritt.
Durch das Kochen wurden alle Proteine denaturiert, auch die Enzyme haben ihre Aktivität verloren. Diese Lösung bleibt rot-violett.

Hinweis:
In der Sammlung von 3D-Modellen an der Univ. Frankfurt findet sich auch die Carboanhydrase II:
Aminosäuren & Proteine - multimedial

Gefahren:
Natronlauge ist ätzend.

Entsorgung:
Die Lösungen können zum Abwasser gegeben werden.

Literatur & Links:
Holger Scholz, Michael Fähling, Peter Ludwig: Modellstudiengang Medizin, Praktikum Gastransport; Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2012
Peter Ludwig & Regina Freund: persönliche Mitteilungen
Chemie für Mediziner

Frau Dipl.-Päd. Regina Freund, Institut für Biochemie der Charité, danke ich sehr herzlich für die Unterstützung.

April 2012: Ein dickes Ei

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Seite erstellt am: Donnerstag, 3. Mai 2012, A. Schunk, Charité - Universitätsmedizin Berlin.  

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